Kaskady biokatalityczne umożliwiają wytwarzanie makrocyklicznego peptydu Enlicitide

Badany przez firmę MSD doustny inhibitor PCSK9, dekanian enlicydu (MK-0616), jest pierwszym doustnym inhibitorem makrocyklicznego peptydu PCSK9, który wykazuje znaczne obniżenie poziomu LDL-C u ludzi. Enlicytyd opracowano na podstawie prezentacji mRNA monocyklicznych peptydów, a następnie stabilizowano za pomocą niepeptydowych wiązań poprzecznych w celu wytworzenia struktury składającej się z trzech połączonych makrocykli. Ten złożony oktapeptyd zawiera sześć nienaturalnych i dwa proteinogenne aminokwasy połączone 12 wiązaniami amidowymi i centralnym, sześciowęglowym łącznikiem łańcucha. Tradycyjna synteza chemiczna wymaga 43 etapów, manipulacji grupami zabezpieczającymi (prawie połowa etapów syntezy), oczyszczania chromatograficznego i etapu metatezy z zamknięciem pierścienia katalizowanej bardzo rozcieńczonym rutenem, co ogranicza skalowalność i trwałość.

Chemoenzymatyczny rozwój produkcji

Naukowcy z MSD opracowali zwięzły i zbieżny proces chemoenzymatyczny umożliwiający wytwarzanie dekanianu enlicytydu (1), możliwy dzięki bezpośredniemu sprzęganiu monomerów za pomocą ligaz aminokwasowych, w połączeniu z biokatalityczną ligacją fragmentów peptydowych i makrocyklizacjami przy użyciu esteraz i reduktaz iminowych.

Kluczowe osiągnięcia

Montaż kaskady trzech enzymów przy użyciu ligaz chwytających ATP

- Kaskada trzech enzymów (dwie zmodyfikowane ligazy chwytające ATP + recykling ATP) składa tetrapeptyd z niezabezpieczonych aminokwasów. Ligazy chwytające ATP (w szczególności ligazy aminokwasów zależne od ATP, AAL) to enzymy, które katalizują tworzenie wiązań amidowych pomiędzy niezabezpieczonymi aminokwasami lub peptydami, wykorzystując ATP jako źródło energii. Ich mechanizm opiera się na mieszanym bezwodniku, który umożliwia bezpośrednie sprzęganie bez konieczności stosowania grup zabezpieczających na aminie nukleofilowej lub aktywowanych donorach acylu. W tym badaniu naukowcy wykorzystali ligazę chwytającą ATP z Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) i zmodyfikowane warianty (Trp-BaAALEng i Phe-BaAALEng), aby selektywnie wydłużyć dipeptyd o dwa niewystępujące w naturze aminokwasy (analogi tryptofanu i fenyloalaniny) w kaskadzie jednonaczyniowej. Ligazy te mają wąską, zakopaną kieszeń elektrofilową, która przyjmuje pojedyncze aminokwasy jako elektrofile (substraty C-końcowe), ale może pomieścić dłuższe peptydy jako N-nukleofile. Ta selektywność czyni je idealnymi do sekwencyjnego składania peptydów bez grup ochronnych od C-końca do N-końca. Zużyty ATP jest poddawany recyklingowi przy użyciu kinazy polifosforanowej (FbPPKWT) z niedrogim heksametafosforanem jako donorem fosforanu.

Zaprojektowana esteraza (RsEstEng) regioselektywna makrolaktamizacja

- Zaprojektowana esteraza (RsEstEng) katalizuje regioselektywną makrolaktamizację z utworzeniem fragmentu północnego (wydajność 73%, skala 52 kg). RsEstEng pochodzi z karboksyloesterazy typu dzikiego (RsEst) zidentyfikowanej z Roseibacillus sp. Jego natywną funkcją jest hydroliza wiązań estrowych. W drodze ukierunkowanej ewolucji badacze przekształcili go w katalizator regioselektywnej makrolaktamizacji – tworzenia makrocyklicznego wiązania amidowego – w syntezie północnego fragmentu (4) enlicydu. Akceptuje stabilny, masywny ester tert-butylowy liniowego tetrapeptydu (9) jako donor acylu w celu wytworzenia makrocyklicznego peptydu (4) w celu utworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania amidowego. Osiągnięto selektywną cyklizację bez wykrywalnych oligomerów i jedynie 0,8% produktu ubocznego hydrolizy estrów, nawet w warunkach wysokiej siły jonowej z poprzedniej kaskady enzymatycznej.

Zaprojektowana ligacja międzycząsteczkowa tioesterazy (BlTEEng).

- Zaprojektowana tioesteraza (BlTEEng) przeprowadza międzycząsteczkową ligację fragmentów północnych (4) i wschodnich (3) bez epimeryzacji. BlTEEng jest zmodyfikowaną wersją domeny tioesterazy (TE), pierwotnie wyciętej z nierybosomalnej syntetazy peptydowej (NRPS) Brevibacillus laterosporus (BlTE). Tioesterazy typu dzikiego w układach NRPS zazwyczaj katalizują makrocyklizację lub uwalnianie liniowych peptydów z białka nośnikowego poprzez wiązanie tioestrowe. Zaprojektowane warianty BlTE wykazały pewną aktywność, ale faworyzowały dimeryczne produkty uboczne. Inżynieria enzymatyczna przesunęła enzym w taki sposób, aby katalizował ligację międzycząsteczkową przy użyciu bardziej stabilnych oksoestrów izopropylu zamiast naturalnych, hydrolitycznie nietrwałych tioestrów.

Makrocyklizacja redukcyjnego aminowania czteroenzymatycznego

- Kaskada czterech enzymów (PsIREDEng, KsKREDEng i enzymy recyklingowe kofaktorów StLDHWT, TvADHWT) umożliwia redukcyjną makrocyklizację aminowania z wytworzeniem bicyklicznej diaminy (wydajność 69%, skala 46 kg). KsKREDEng to zmodyfikowana ketoreduktaza firmy Kyrpidia sp. Katalizuje utlenianie związku alkoholu benzylowego (10) do przejściowego aldehydu (11) zależnego od NAD+. PsIRED jest reduktazą iminową z Pseudogymnoascus sp. Jest zależny od NADPH. PsIREDEng katalizuje redukcyjne aminowanie aldehydu (11) i istniejącej aminy z wytworzeniem cyklicznej iminy (12), po której następuje redukcja do makrocyklu aminy drugorzędowej (13). StLDHWT regeneruje NAD+ na etapie utleniania poprzez redukcję pirogronianu do mleczanu, podczas gdy TvADHWT regeneruje NADPH na etapie redukcyjnym poprzez utlenianie izopropanolu do acetonu.

Końcowa makrocyklizacja za pomocą zmodyfikowanej tioesterazy PBP

- Chemiczne sprzęganie z fragmentem zachodnim (2), po którym następuje zmodyfikowana tioesteraza białkowa wiążąca penicylinę (SsPBP-TEEng), zamyka końcowy makrocykl przy wysokim stężeniu (70 g/l) – pokonując typowe ograniczenie rozcieńczenia (5 g/l w tradycyjnej syntezie). Cały proces obejmuje trzy etapy kaskadowe, 7 zmodyfikowanych enzymów + 3 pomocnicze, całkowitą wydajność 39%, demonstrację w skali wielokilogramowej, czystość> 99%, brak chromatografii i bez grup ochronnych. Praca ta zapewnia zrównoważony, skalowalny plan wytwarzania złożonych makrocyklicznych peptydów, radykalnie zmniejszając liczbę etapów i ilość odpadów, jednocześnie poprawiając wydajność i dostęp pacjenta.