Naturalne peptydy są doskonałymi „kluczami molekularnymi” – charakteryzują się wysokim powinowactwem, dobrą selektywnością i niską toksycznością. Jednakże z natury mają trzy główne wady: łatwo ulegają rozdrobnieniu przez proteazy, mają trudności z przenikaniem przez błony komórkowe i zbyt krótko pozostają w organizmie. W ciągu ostatnich trzydziestu lat specjaliści z branży farmaceutycznej systematycznie eliminowali te niedociągnięcia, korzystając z „zestawu narzędzi zawierających specjalne aminokwasy”. W tym artykule zastosowano prosty język i dużą liczbę wykresów, aby pomóc pracownikom działu badawczo-rozwojowego CMC zdemontować i zrozumieć ten zestaw narzędzi od zasady do wdrożenia.
I. Dlaczego naturalne peptydy są „niewystarczające”
II. Przegląd pięciu głównych strategii modyfikacji
III. N-metylacja
IV. α-Metylacja i Aib
V. Aminokwasy o konfiguracji D
VI. Aminokwasy nienaturalne
VII. Kompleksowy przypadek: jak powstają peptydy doustne
VIII. Skrócona strona referencyjna dla partnerów CMC
IX. Przyszłe trendy w projektowaniu: sztuczna inteligencja i technologia wyświetlania
Stosowanie naturalnego polipeptydu (złożonego w całości z 20 aminokwasów typu L) bezpośrednio jako lekarstwo często nie trwa dłużej niż kilka minut. Powód można podsumować w jednym zdaniu: ludzki układ metaboliczny jest z natury zaprojektowany tak, aby rozpoznawać i rozkładać tę strukturę. Przejawia się to szczególnie w postaci czterech powiązanych ze sobą pytań.
①Degradacja proteaz – najbardziej śmiercionośne osocze, wątroba, nerki i przewód pokarmowy wypełnione są peptydazami/proteazami (takimi jak DPP-4, aminopeptydaza, karboksypeptydaza, trypsyna itp.), które specyficznie rozpoznają wiązania amidowe typu L i hydrolizują je. Okres półtrwania naturalnego GLP-1 w organizmie wynosi tylko około 1,5 do 2 minut.
②Słaba przepuszczalność błony i trudne podawanie doustne: Duża ilość amidu N-H w szkielecie polipeptydowym jest silnym donorem wiązań wodorowych i jest ściśle owinięta cząsteczkami wody, co utrudnia przejście przez hydrofobowy rdzeń błony komórkowej. Jest to podstawowy powód, dla którego zdecydowaną większość peptydów można podawać wyłącznie w formie zastrzyków.
③Dzięki krótkiemu okresowi półtrwania i szybkiemu klirensowi nerkowemu polipeptydy o małej masie cząsteczkowej (<5 kDa) są szybko filtrowane i usuwane przez kłębuszki. W połączeniu z hydrolizą enzymatyczną poziom ekspozycji w organizmie jest trudny do utrzymania i wymagane jest częste podawanie.
④Liniowe polipeptydy o elastyczności konformacyjnej i słabej selektywności są jak „miękki makaron” w roztworze, z niezliczoną liczbą konformacji szybko zmieniających się. Podczas wiązania z celem utrata entropii jest duża, powinowactwo jest pomijane, a także może błędnie wiązać się z wieloma powiązanymi receptorami, co prowadzi do odbiegania od celu.
Strategia „specjalnego aminokwasu” polega zasadniczo na precyzyjnej naprawie tych czterech słabych punktów: bez zakłócania konformacji farmakodynamicznej modyfikuje szkielet i łańcuchy boczne, umożliwiając cząsteczce „unikanie” rozpoznania przez enzym, „usuwanie” nadmiaru wiązań wodorowych i „blokowanie” aktywnej konformacji, przy jednoczesnym zachowaniu możliwie największego dopasowania do celu.
Najpierw skorzystaj z tabeli, aby ustalić ogólne zrozumienie. Poniższych pięć rodzajów modyfikacji to najczęściej stosowane metody „specjalnych aminokwasów” we współczesnym projektowaniu leków peptydowych i zostaną one szczegółowo omówione w kolejnych rozdziałach.
N-metylacja to proces zastąpienia wodoru (n-H) przy atomie azotu szkieletowego wiązania amidowego grupą metylową (n-CH₃). Pozornie niewielka zmiana może jednocześnie wywołać cztery kluczowe parametry farmakokinetyki. Mechanizm jego działania można podzielić na trzy poziomy.
Każdy N-H jest silnym donorem wiązań wodorowych, „unieruchamiającym” cząsteczkę w fazie wodnej. Usunięcie tego donora przez N-metylację zmniejsza polarną powierzchnię (PSA) cząsteczki, umożliwiając cząsteczce „odwodnienie” i wejście do hydrofobowego rdzenia membrany. Efekty N-metylacji w wielu miejscach można nałożyć na siebie – klasyczny analog somatostatyny Vebera-Hirschmanna, po N-metylacji w trzech miejscach, ma biodostępność po podaniu doustnym wynoszącą około 10%.
Grupa metylowa zajmuje przestrzeń w pobliżu wiązania amidowego. Aktywna kieszeń proteazy nie może prawidłowo „ugryźć” wiązania rozszczepiającego, co znacznie zwiększa stabilność metaboliczną. Jest to fizyczna podstawa, na której N-metylacja jest bezpośrednio powiązana z odpornością na hydrolizę enzymatyczną.
Prawie wszystkie zwykłe wiązania amidowe są trans (trans), podczas gdy N-metylacja przybliża różnicę energii między cis (cis), ułatwiając przełączanie między konformacjami cis-trans. Projektanci mogą w ten sposób „indukować” cząsteczki do fałdowania się w określone aktywne konformacje lub tworzenia wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych w celu ukrycia grup polarnych (co dodatkowo ułatwia penetrację).
Ten lek immunosupresyjny jest podręcznikiem „synergistycznego działania specjalnych aminokwasów”. Jest to 11-resztowy cykliczny peptyd zawierający 7 szkieletowych N-metylacji i jedną D-alaninę. To właśnie ta gęsta N-metylacja i cyklizacja umożliwia mu utrzymanie aktywności w jamie ustnej, zachowując jednocześnie niezwykle silną stabilność metaboliczną - może „przemieniać ubrania” pomiędzy roztworem wodnym a środowiskiem błonowym, tworząc wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, aby ukryć polarność i przejść przez błonę, a następnie otworzyć się, aby związać się z celem w fazie wodnej. Cyklosporyna stała się zatem jednym z niewielu naturalnych źródeł makrocyklicznych peptydów „wykraczających poza Regułę Pięciu”, które można wchłaniać doustnie.
N-metylowane aminokwasy to drugorzędowe aminy z zawadą przestrzenną, o niskiej wydajności sprzęgania, powolnej reakcji i wysoce podatne na racemizację i skrócenie diketopiperazyny (DKP). Wymagane są silniejsze odczynniki sprzęgające (takie jak HATU/COMU + dodatki), wydłużony czas sprzęgania lub podwójne sprzęganie, ścisła kontrola temperatury i monitorowanie online każdego etapu. Wybór lokalizacji jest bardzo czuły: N-metylacja w różnych miejscach tej samej sekwencji może mieć bardzo różny wpływ na aktywność i penetrację, dlatego wymagane jest badanie przesiewowe miejsce po miejscu.
N-metylacja obejmuje wodór na atomie azotu. α-metylacja obejmuje wodór na węglu α. Kiedy pierwotny wodór na węglu α zostaje zastąpiony grupą metylową, węgiel α zmienia się z „tripodstawionego” na „tetrapodstawiony węgiel czwartorzędowy” (najbardziej typowym przykładem jest Aib, kwas 2-aminoizomasłowy, który jest równoważny dodaniu kolejnej grupy metylowej do węgla α alaniny i jest symetryczny po obu stronach). Daje to potrójny efekt.
Blokowanie konformacyjne (większość rdzeni)
Antyproteaza
Wyeliminuj słabości chiralne
Naturalny GLP-1 jest precyzyjnie odcinany od 8. pozycji N-końca przez DPP-4, z okresem półtrwania wynoszącym zaledwie 1,5 do 2 minut. Kluczowym ruchem semaglutydu jest zastąpienie alaniny (Ala8) na 8. pozycji Aib (α,α-dipodstawionym) - zawada przestrzenna czwartorzędowego węgla sprawia, że DPP-4 „nie jest w stanie ugryźć” tego miejsca, blokując w ten sposób główną drogę degradacji ze źródła.
Trzy kolejne modyfikacje wydłużyły okres półtrwania z minut do jednego tygodnia:
① Aib8 opiera się na cięciu DPP-4;
② Zastąpienie Arg34 pozwala uniknąć degradacji w innym miejscu i sprzyja specyficznej dla miejsca lipidacji.
③ Długołańcuchowy dikwas tłuszczowy Lys26 (dikwas C18 + łącznik) odwracalnie wiąże się z albuminami surowicy i unika klirensu nerkowego.
Kompleksowe wyniki: Okres półtrwania wynosi około 165 godzin (około 1 tygodnia) i lek można podawać raz w tygodniu.
Aib jest także aminokwasem stanowiącym zawadę przestrzenną, charakteryzującym się powolnym sprzęganiem. Aminokwasy Aib-aib lub AIB często wymagają podwójnego sprzęgania lub silnej aktywacji. Warto zauważyć, że „nienaturalny” status Aib stwarza przeszkody na drodze rekombinacyjnej fermentacji (rybosomy tego nie rozpoznają). Dlatego peptydy zawierające Aib, takie jak Simaglutyd, zwykle opierają się na syntezie w fazie stałej (SPPS) lub strategiach hybrydowych w fazie stałej + fermentacji i są łączone ze specyficzną dla miejsca modyfikacją łańcuchów bocznych kwasów tłuszczowych. Złożoność procesu i kontroli jakości jest znacznie wyższa niż w przypadku zwykłych rekombinowanych peptydów.
Aktywna kieszeń proteazy to „rękawica” skrojona na miarę dla substratu L. Kiedy D-aminokwasy są zastępowane w pobliżu wiązania rozszczepiającego, geometryczny związek między grupą karbonylową substratu a triadą katalizowaną przez enzym zostaje zakłócony. Wiązania rozszczepiającego nie można umieścić we właściwej pozycji reakcji, powinowactwo wiązania gwałtownie spada i w ten sposób zatrzymuje się hydroliza.
Odwraca całą sekwencję, zastępując każdą resztę resztą w kształcie litery D. Magia polega na tym, że w dużej mierze zachowane jest względne rozmieszczenie łańcuchów bocznych w przestrzeni, zachowując w ten sposób pierwotną aktywność. Jednakże szkielet jest w pełni D, całkowicie odporny na proteazy, a immunogenność jest znacznie zmniejszona. Jest to potężne narzędzie do projektowania peptydów wahadłowych bariery krew-mózg i peptydów długo działających.
Cena surowca D-aminokwasów jest zwykle wyższa niż typu L, a dostawców jest mniej. Należy zwrócić uwagę na kontrolę czystości chiralnej (wartość ee) i zanieczyszczeń enancjomerycznych.
Oprócz wyżej wymienionych modyfikacji na poziomie szkieletu, profesjonaliści farmaceutyczni mają do wyboru także setki skomercjalizowanych „dobrze chronionych i dobrze aktywowanych” nienaturalnych elementów budulcowych aminokwasów. Są jak klocki Lego, złożone w sekwencje według funkcji.
„Specjalne aminokwasy” dotyczą stabilności i konformacji molekularnej. Aby przekształcić polipeptydy w leki doustne, istnieją w rzeczywistości dwie niezależne, ale nałożone na siebie drogi „dotarcia”.
Pierwszy etap: Przetrwaj. Specjalne aminokwasy (Aib, N-metylowane, typu D) są odporne na degradację przez proteazy żołądkowo-jelitowe.
① Wewnętrzna przenikalność molekularna: N-metylacja redukuje wiązania wodorowe/PSA, cyklizacja + hydrofobowe łańcuchy boczne promują wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe i fałdowanie „kameleona”.
② Promowanie penetracji preparatu: SNAC, dekanian sodu i TPE tymczasowo otwierają/przechodzą przez barierę nabłonkową jelit.
Trzeci etap: utrzymanie konformacji albuminy wiążącej łańcuch boczny kwasu tłuszczowego/długo działającej w celu utrzymania ekspozycji na lek we krwi.
Przyszłe cząsteczki będą zawierać coraz więcej „trudnych” nienaturalnych aminokwasów i struktur makrocyklicznych.
Prezentacja mRNA (taka jak system RaPID) umożliwia przeszukiwanie bibliotek peptydów w skali od 10¹² do 10¹³ za jednym razem.
RFdiffusion, zmodyfikowany AlphaFold (taki jak kodowanie pozycji cyklicznego peptydu w AfCycDesign) i generatory uczenia się przez wzmacnianie były w stanie zaprojektować od podstaw duże peptydy cykliczne/wiążące.
Wiązanie olefin z łańcuchami bocznymi, blokowanie α-helisy, podstawienie wiązań wodorowych, składanie β/γ-aminokwasów i inżynieria szkieletu na poziomie atomowym stopniowo rozwiązują tradycyjny problem ukierunkowania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko (PPI).
Zastosowanie specyficznych dla miejsca miejsc koniugacji zapewnianych przez aminokwasy niewystępujące w naturze w celu przyłączenia toksyn, nuklidów lub fluorescencji w celu skonstruowania „wersji peptydu ADC”. Jednocześnie technologia promowania penetracji ustnej staje się coraz bardziej dojrzała. „Specjalne aminokwasy + preparaty” umożliwią przyjmowanie doustne większej liczby polipeptydów, które pierwotnie były przeznaczone wyłącznie do wstrzykiwania.
